Multiphotonenmikroskopie
Die Multiphotonenmikroskopie (MPM) ist ein Verfahren zur Bildgebung von fixierten sowie lebendem biologischen Gewebe. Durch die Verwendung eines Femtosekundenlasers ist im Gegensatz zur konventionellen Fluoreszenzmikroskopie (FM) eine simultane Manipulation der Probe möglich. Die Multiphotonenmikroskopie eröffnet somit eine Vielfalt von neuen Anwendungen im Bereich der Zellbiologie.
Beide Methoden basieren auf der Anregung von Molekülen durch die Absorption von einem Photon (FM) oder die simultane Absorption von zwei oder mehreren Photonen (MPM) in höhere Singulett Niveaus (S1 bis SN, siehe Abbildung 1). Aus diesem Zustand relaxiert das Molekül strahlungslos in das erste Singulett Niveau S1. Von dort aus kann es entweder durch die Emission von Fluoreszenz in den Grundzustand (hνF) zurückkehren oder durch Intersystem Crossing in ein angeregtes Triplett Niveau übergehen. Da der letztgenannte Prozess spinverboten ist, hat er eine geringere Übergangsrate als die Fluoreszenzemission. Ein Übergang aus dem Triplett-Zustand in den Grundzustand ist ebenfalls spinverboten, so dass die daraus resultierende Phosphoreszenz (hνP) eine lange Lebensdauer bis zu einigen Stunden hat.
- Abbildung 1: Jablonskidiagramm für 1 und 2-Photonen-Anregung von Molekülen vom Grundzustand S0 in höhere Singulett Niveaus (S1,S2). hvA ist die Energie eines Photons bei Ein- bzw Zwei-Photonen-Anregung, hvF die Energie des induzierten Fluoreszenzphotons und hvP die Energie eines Phosphoreszenzphotons nach Intersystem-Crossing.
Second Harmonic Generation (SHG)
Die fs-Laserpulse erlauben zusätzlich zum Anregen der Fluoreszenz die Anwendung weiterer Bildgebungsverfahren. Durch nichtlineare Frequenzkonversion an bestimmten Gewebestrukturen, wie z.B. Kollagen, wird die eingestrahlte Laserfreqenz verdoppelt, die sogenannte Second Harmonic Generation (SHG).
Gewöhnliche Fluoreszenzfarbstoffe werden linear im UV-und sichtbaren Wellenlängenbereich (350-550 nm) angeregt. Durch eine Zweiphotonenabsorption ist die Applikation von Wellenlängen im sogenannten "diagnostischen Fenster" (700-1100 nm) möglich, woraus eine um mehrere Größenordnungen höhere Eindringtiefe in biologischem Gewebe folgt. Da der Zwei(Mehr)-Photonen-Wirkungsquerschnitt von Molekülen jedoch deutlich geringer ist, muss eine hohe räumliche und zeitliche Fokussierung des Laserstrahls vorliegen, um bei der MPM ein messbares Fluoreszenzsignal zu erhalten. Daher wird im Gegensatz zu Dauerstrichlasern in der FM der Einsatz von Femtosekundenlasern für die MPM nötig.
Der große Vorteil der MPM ist die nichtlineare Abhängigkeit der Wahrscheinlichkeit für eine Multiphotonenabsorption von der Intensität des Lasers. Folglich ist bei einer Fokussierung des Laserstrahls die Anregung auf das fokale Volumen beschränkt, so dass im Gegensatz zur FM keine aufwendige Unterdrückung der Fluoreszenz aus den Ebenen unterhalb und oberhalb des Fokus notwendig ist (siehe Abbildung 2).
- Abbildung 2: (a) 1-Photonen-Anregung in einem herkömmlichen Fluoreszenz-Mikroskop: Die Mitochondrien einer Granulosa-Zelle sind mit Mitotracker Orange angefärbt, jedoch aufgrund der Fluoreszenzbeiträge aus verschiedenen Ebenen nicht auflösbar.
- (b) 2-Photonen-Fluoreszenz-Bild einer Endothelzelle, die Mitochondrien sind nun aufgrund der erhöhten axialen Auflösung gegenüber der herkömmlichen Fluoreszenz-Mikroskopie deutlich zu erkennen.
- Abbildung 3: Schematischer Aufbau eines Multiphotonenmikroskops.
Ein gewöhnliches Multiphotonenmikroskop basiert auf einem kommerziell erhältlichen Lichtmikroskop. Der Laserstrahl wird über zwei Scanspiegel in das Mikroskop eingekoppelt und vom dichrotischen Strahlteiler zum Objektiv reflektiert.(siehe Abbildung 3). Das Objektiv fokussiert den Strahl in die Probe, so dass im fokalen Volumen Moleküle durch eine Multiphotonenabsorption angeregt werden. Die darazus resultierende Fluoreszenz wird auf dem umgekehrten Weg durch das Objektiv in den Mikroskoptubus geleitet, wo sich ein Photomultiplier befindet. Durch die zweidimensionale Abrasterung der Probe durch die Scanspiegel wird das Fluoreszenzsignal Pixel für Pixel über einen PC verarbeitet und das Bild erstellt.
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- Abbildung 4: Schematischer Aufbau eines faserbasierten Multiphotonenmikroskops.
Für in vivo Anwendungen soll ein faserbasierten Aufbau eines Multiphotonen-Mikroskopes mit miniaturisiertem Scanner realisiert werden, wie in Abbildung 4 schematisch dargestellt. Das Licht wird zunächst in einer optischen Faser geführt, wobei auftretende dispersive Effekte durch einen Pulskompressor vorkompensiert werden müssen, sodass man nach der Faser fs-Pulse erhält. Ein miniaturisierter Applikator enthält eine Scaneinheit zum lateralen Abrastern der Probe sowie eine fokussierende Optik. Da auch hier Standard-Mikroskopobjektive zu groß sind, werden Gradientenindexlinsen (GRIN-Objektiv) eingesetzt. Das Fluoreszenzlicht wird auf dem umgekehrten Weg in der Faser zurückgeführt und mittels Photomultiplier detektiert.
Ansprechpartner: Sabine Donner
Zweiphotonenmikroskopie der Kornea
Die Kornea besteht aus mehreren Epithelzelllagen gefolgt vom Stroma und schließlich dem Endothel. Zwischen Epithel und Stroma ist die Bowman Membran (insbesondere bei der humanen Kornea) und zwischen Stroma und Endothel die Descemet Membran. Mit der optisch nichtlinearen Mikroskopie lassen sich die Zellen der intakten Kornea (Epithel und stromale Keratozyten) über die mit zwei Photonen angeregte Eigenfluorszenz des NAD(P)H darstellen (rechts im Bild grün).
Die Hauptkomponete des Stroma ist Collagen-1, das in Fibrillenlagen organisiert ist. Collagen-1 besitzt eine Hyperpolarisierbarkeit und hat einen nicht verschwindenden Suszeptibilitätstensor zweiter Stufe. Eingestrahltes Infrarotlicht erzeugt demnach einen Polarisationanteil mit quadratischer Abhängigkeit vom elektrischen Feld. Diese Polarisation induziert eine Lichtwelle mit der zweifachen Frequenz, die Zweite Harmonische (Second Harmonic Generation). Diese kann vorwärts in Einstrahlrichtung (weiß) oder - durchaus mit Unterschieden - auch in rückwärts Richtung (blau) beobachtetet werden. Zusätzlich kann noch das lineare Streulicht der Fundamentalen mit einem Detektor hinter der konfokalen Blende erfasst werden (rot).
Ansprechpartner: Alexander Krüger
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