Laser-Transfektion - DNA Transfer in lebende Zellen
- Abb. 1: Allgemeines Schema zum Ablauf der Transfektion: 1) Die Plasmid DNA muss in die Zelle eingebracht werden. Hierfür kann z.B. die Lasertransfektion angewandt werden. 2) Die DNA muss in den Zellkern gelange, um dort 3) in mRNA transkribiert zu werden. Die mRNA wird wieder in das Zytoplasma transportiert, wo die kodierten Informationen dann 4) zur Produktion eines Proteins genutzt werden können.
Die Manipulation von Säugerzellen stellt in der Molekularbiologie als auch in der regenerativen Medizin eine fundamentale Methodik dar. Das gezielte Einbringen von extrazellulären Molekülen in die Zelle erlaubt es, ihre Eigenschaften zu beeinflussen. Meistens werden hierfür codierende DNA Sequenzen in die Zelle eingeschleust (auch Transfektion genannt), woraufhin die Zelle die auf der DNA gespeicherten Erbinformationen abliest und die entsprechenden Proteine produziert. Diese können dann wiederum das Verhalten der Zelle beeinflussen.
Ein aktuelles Beispiel aus der regenerativen Medizin stellt die Produktion sogenannter iPS Zellen (für induced pluripotent stem cell) dar: Mit Hilfe verschiedener Reprogrammierungsfaktoren lassen sich ausdifferenzierte, adulte Zellen, wie z. B. Fibroblasten aus der Haut, in einen stammzellähnlichen Zustand umprogrammieren. Hierfür werden DNA Sequenzen, welche für die Reprogrammierungsfaktoren kodieren, in die Zielzellen eingebracht, woraufhin die Faktoren von der Zelle selber produziert werden. Dies ist ein vielversprechender Ansatz, da man so eine autologe (also aus dem Patienten selber stammende) Zellquelle hätte, die leicht verfügbar wäre und die regenerativen Eigenschaften von Stammzellen aufweist. Somit wären die zum einen die ethischen Probleme bei der Verwendung von embryonalen Stammzellen und zum anderen mögliche Abstoßungsreaktionen bei der Verwendung von allogenen Zellen umgangen.
Etablierte Methoden zum Transport der DNA Sequenzen werden allgemein in drei Kategorien aufgeteilt: Chemische, physikalische und biologische Methoden. Für therapeutische Anwendungen werden am häufigsten virale Vektoren, welche zu den biologischen Methoden zählen, verwendet. Sie erlauben meistens hohe Transfektionseffizienzen in Primärzellen. Dennoch beherbergen virale Vektoren einige Nachteile: Abhängig vom verwendeten Vektor werden die eingeschleusten DNA Sequenzen fest in das Wirtsgenom eingebaut. Hierbei kann es zu Störung in dem normalen Transkriptionsmuster kommen, was wiederrum negative Effekte, wie z. B. Leukämien, hervorrufen kann. Zudem können manche Zellarten, speziell auch Stammzellen, nicht oder nur sehr ineffizient mit viralen Vektoren transfiziert werden. Da auch andere Transfektionsmethoden hier an ihre Grenzen stoßen, ist die Entwicklung alternativer Methoden von großem Interesse.
Optoporation
Die Lasertransfektion, auch Optoporation genannt, stellt hierbei eine vielversprechende Möglichkeit da. Mit Hilfe eines Laserstrahls wird die Zellmembran für einige Millisekunden permeabilisiert. Diese Zeit reicht aus, um die Diffusion von extrazellulären Molekülen, wie z. B. DNA, in die Zelle zu erlauben. Dieser Mechanismus ist vergleichbar zur Elektroporation, einem weiteren, viel verwendeten Transfektionsverfahren. Allerdings sterben durch die Elektroporation ca. 50 % der Zellen ab und es kann zudem zur Integration von DNA kommen, wohingegen die Lasertransfektion eine weitaus schonendere Methode darstellt.
Es wurde gezeigt, dass die Verwendung von fs-Laserpulsen in Kombination sehr kurzen Bestrahlungszeiten (ca. 40 ms) sehr effizient für den Transport von verschiedenen Molekülen genutzt werden kann. Auch die prinzipielle Möglichkeit zur Transfektion mit Hilfe dieser Methode wurde demonstriert. Allerdings muss der Laserfokus für die Perforation auf die Zellmembran jeder einzelner Zelle gerichtet werden, so dass der Durchsatz gering ist.
Wir arbeiten an verschiedenen Ansätzen den Prozess zu automatisieren und damit den Durchsatz zu erhöhen. Mögliche Wege dies zu erreichen sind die Verwendung von Mikrofluidik und optischen Pinzetten. Ein weiterer Ansatz der zurzeit verfolgt wird ist die unten beschriebene Gold Nanopartikel (AuNP) vermittelte Lasertransfektion.
- Abb. 2: Skizze der Durchflussperforation: Die Zellen werden hydrodynamisch zu einem dünnen Strahl auf der Achse des Mikrofluidikkanals fokussiert. Sie fließen, umgeben von einer Lösung der mit den einzubringenden Moleküle, am Laserfokus vorbei. Die Zellmembran wird dadurch für kurze Zeit permeabilisiert, sodass die Moleküle ins Cytoplasma diffundieren können.
Goldnanopartikel vermittelte Lasertransfektion
- Abb. 3: a) Fluoreszenzbild von ZMTH3 Zellen, in die mit Hilfe der Goldnanopartikel gestützten Lasertransfektion ein DNA Plasmid eingebracht wurde. Die grüne Fluoreszenz zeigt, dass das Plasmid erfolgreich in die Zelle transportiert und dort abgelesen wurde. b) Environmental Scanning Electron Microscop (ESEM) Bild von ZMTH3 Zellen, welche zuvor mit 200 nm Goldpartikeln inkubiert wurden. Die Partikel lagern sich auf der Zelloberfläche an und werden zum Teil auch in die Zelle aufgenommen.
Bei der Gold Nanopartikel (AuNP) vermittelte Lasertransfektion werden die Zellen vor der Laserbestrahlung mit AuNP inkubiert, sodass sich die Partikel direkt an die Zellmembran anlagern. Bei der anschließenden Bestrahlung wird der Laserstrahl nicht wie bei der Optoporation stark, sondern nur schwach oder gar nicht fokussiert. Plasmonische Effekte, welche aus der Interaktion zwischen den AuNP und dem Laserlicht resultieren, führen bei dieser Methode zur Perforation der Zellmembran. Da der Effekt des einfallenden Laserlichtes durch die AuNP lokal verstärkt wird, kann ein großer Fokusdurchmesser gewählt werden (ca. 100 µm), was ein schnelles Abrastern der Probe erlaubt.
Wir konnten zeigen, dass mit dieser Methode eine hohe Transporteffizienz für kleinere Moleküle bei hohem Durchsatz erreicht werden kann. Erste Ergebnisse zeigen, dass auch Transfektion von Zellen mit Hilfe dieser Technik möglich ist. Momentan wird an der weiteren Optimierung der Transfektionsparameter (Anzahl der Pulse, Wellenlänge etc.) und des Transfektionsprotokolls gearbeitet, um auch für die Transfektion zufriedenstellende Effizienzen erreichen zu können.
- Abb. 4: ZMTHe3-Zellen (canine Zellen), die durch Wechselwirkung von Laserstrahlung an Goldoberfläche und der Zellmembran perforiert wurde. Erfolgreich perforierte Zellen zeigen eine grüne Fluoreszenz. Nur im gelaserten Bereich sind die Zellen erfolgreich perforiert worde.
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